O principal método de controle da doença azul, ou mosaico-das-nervuras, é a resistência genética das plantas ao vírus. A identificação de marcadores moleculares ligados ao loco de resistência significa auxílio no melhoramento genético. Foi isso que o trabalho realizado pela Embrapa Algodão objetivou: buscar a validação de metodologias associadas à reações de PCR na detecção de microssatélites, usados no mapeamento molecular da doença.
O mapeamento da metodologia Bulked Segregant Analysis (BSA) foi validada pela Embrapa Algodão e permitirá maior facilidade no mapeamento genético futuro. Foram usados genótipos MT121 e DeltaOpal para obtenção de uma população F1 e F2. Inicialmente, foram avaliados métodos de realização de bulks para estimar o número máximo de indivíduos que permite visualização de um alelo na mistura. Para tal, fez-se teste de mistura de DNA da geração F1 (híbrida) com o genótipo MT121, variando na proporção 1:1 a 1:10.
Para realizar o teste foram feitas reações de PCR com 5 ng de DNA em volume de 20µL (microlitro), em condições padrão. Depois, testados oito pares de primers. Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel desnaturante de poliacriamida 6% e visualizados após coloração com nitrato de prata. Também foi verificada a robustez das reações de PCR através da obtenção dos limites detectores do DNA, usando diferentes quantidades (de 3 a 5 ng) nas reações.
A amplificação dos genótipos da população F2 usou a mesma reação, porém com 4 ng de DNA de cada genótipo e volume final de 14µL. O melhor padrão de amplificação foi do primer CIR249 – permite detectar a presença de alelo em bulks de até 5 indivíduos. Para o DNA genômico de uma única planta, a utilização de 3 a 5 ng resulta em reações com padrões visuais satisfatórios. E cada um dos 62 indivíduos da população F2 foi avaliado por 29 pares de primers que amplificam locos de microssatélites de 16 diferentes cromossomos dos 26 do algodoeiro.