Com o objetivo de identificar as proteínas relacionadas aos mecanismos de resistência do algodão, foi efetuado um estudo proteômico comparativo das raízes de genótipos suscetíveis e resistentes ao nematóide das galhas. O processo constituiu-se de extração de nematóides e inoculação das plantas e extração das proteínas e eletroforese bidimensional.
Para a extração de nematóides e inoculação das plantas, raízes de tomateiro infectadas – com muitas galhas – foram lavadas com água e trituradas em hipoclorito de sódio 0,5%, a fim de se obter os juvenis de segundo estágio 2 (J2) de M. Incognita. O material resultante foi peneirado e os ovos colocados para eclodir. Em seguida, os J2 foram centrifugados por cinco minutos a 2.500 x g, coletadas e contadas em câmara de Newbauer.
O algodão, linhagem resistente IAC02-2190, e a variedade suscetível COODETEC 401, com cerca de 30 centímetros de altura e dois meses de idade, cultivadas em sacos plásticos contendo solo autoclavado, foram infectadas com aproximadamente 20 mil J2. As plantas foram mantidas em casa de vegetação e as raízes coletadas após cinco e 15 dias de inoculação. As raízes foram lavadas em água corrente, congeladas em nitrogênio líquido e maceradas com o uso de almofariz e pistilo. Como controle, usou-se plantas da mesma idade, não infectadas.
Na extração das proteínas e eletroforese bidimensional, o material vegetal macerado foi homogeneizado em tampão de extração na proporção 1:3 (p/v) sob agitação leve, por duas horas, a 4º C. Três tampões de extração foram testados e centrigugados a 10.000 x g por 45 minutos, a 4º C. Os sobrenadantes foram homogeneizados com TCA 10% em acetona gelada e as proteínas precipitadas durante a noite.
Na eletroforese 2-D, as proteínas foram solubilizadas em solução de ureia 7M, tiourea 2M, CHAPS 4%, IPG Buffer 2% e DTT 0,3%. Cerca de 200 gramas de proteínas foram aplicados em tiras IPG de 18 centímetros, pH 3-10. A focalização isoelétrica foi realizada no sistema Multiphor II e a segunda dimensão no sistema ETTAN DaltSix. Os géis 2-DE foram corados com Coomasie Coloidal, as comparações entre eles feitas por inspeção visual, e os spots diferenciais excisados dos géis e digeridos com tripsina.
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Análise proteômica de raízes do algodoeiro infectadas por nematóides das galhas
Resultados da análise proteômica de raízes do algodoeiro infectadas por nematóides das galhas