O protocolo de extração fácil e rápido de ácido ribonucleico (RNA), proposto pelo estudo da Embrapa Algodão, rende uma quantidade de RNA de boa qualidade, dependendo do tecido vegetal. O resultado final indica que apenas quando foram usados tecidos de folhas se obteve quantidade pequena de RNA, comparado ao obtido a partir de hastes e raízes.
Isso sugere que o RNA de folhas pode ter sido perdido por ligação a polissacarídeos, polifenóis ou outros componentes durante a extração, apesar da utilização de polivinilpirrolidona (PVP) insolúvel, que facilita a remoção de muitos dos polifenóis e polissacarídeos, ajudando na dissociação desses compostos. A integridade do RNA é evidente no gel de agarose nativo a 1%, podendo se ver as bandas correspondentes a 28S e 18S.
Para chegar a esse resultado, foi necessário macerar 400 miligramas de tecido em um cadinho contendo nitrogênio líquido até a obtenção de um pó fino e transferir para um microtubo – 1,5 mililitro – contendo 1 mililitro de tampão citrato de sódio 5 mmol L pH 7,0, acrecido de 0,1% de β-mercaptoetanol (1µL – microlitro) e 2% de PVP – 200 microlitros de PVP 10%. Em seguida, verter o tubo durante um minuto para misturar a amostra e adicionar 400 microlitros de FCA (fenol:clorofórmio:álcool isoamílico, 25:24:1, v/v/v).
Em seguida, verter o tubo na bancada por cinco minutos em temperatura ambiente; centrifugar a 10 mil rpm (9000 x g) por três minutos em temperatura ambiente; transferir o sobrenadante para um novo tubo previamente gelado e conservar no gelo. Depois, adicionar 1,4 mililitro de cloreto de lítio (LiCl) 4 M e estocar o tubo por duas horas, a 4º Celsius. Novamente, centrifugar a 10 mil rpm por cinco minutos em temperatura ambiente, descartar o sobrenadante e adicionar 1 mililitro de etanol 70% gelado.
Por fim, foi preciso estocar o tubo por cinco minutos a -20º Celsius, centrifugar a 10 mil rpm por cinco minutos em temperatura ambiente; descartar o sobrenadante, dar um spin rápido e retirar o etanol residual com o auxílio de uma pipeta; deixar secar na bancada e ressuspender em 20 microlitros de água ultrapura.
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