O RNA mensageiro (RNAm) é o tipo mais utilizado em pesquisas de biologia molecular, visando o melhoramento das plantas, que permite determinar onde e quando determinado gene está sendo expresso, para o posterior entendimento da sua função. Uma das estratégias do seu estudo é a análise da expressão diferenciada de genes em respostas de tolerância, de resistência ou de fatores envolvidos com a interação patógeno-hospedeiro.
Efetuam-se testes usando vários protocolos de extração com a finalidade de neutralizar o efeito oxidativo dos compostos fenólicos presentes nas folhas de algodão sobre o RNA Total. Com isso, pode-se estabelecer que tal protocolo, no qual foi usado o reagente “Concert™ Plant RNA Reagent”, foi o que melhor atendeu ao objetivo proposto.
O processo de extração
Foram coletadas folhas jovens medindo, aproximadamente, dois centímetros e meio e armazenadas em nitrogênio líquido. De cada amostra, 0,1 grama foi macerado em nitrogênio líquido com o auxílio de pistilos e almofarizes de porcelana previamente resfriados, até transforma-se num pó fino, que foi transferido para microtubos, aos quais foi adicionado depois 0,5 mililitros de “Concert™ Plant RNA Reagent”.
O material contido nos microtubos foi lentamente misturado e incubado por cinco minutos à temperatura ambiente, tendo-se o cuidado de deixá-los sempre na posição horizontal, para aumentar a superfície de contato. Após o período de incubação, o material foi centrifugado a 12 mil rotações por minuto (rpm), por dois minutos, à temperatura ambiente e o sobrenadante transferido para um novo microtubo.
Em seguida, foi adicionado 0,1 mililitro de cloreto de sódio (NaCI) 5M e 0,3 mililitros de clorofórmio em cada tubo e invertidos por dois minutos. Eles foram centrifugados a 12 mil rpm à temperatura de 4º Celsius por dez minutos. Os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos, aos quais foi adicionado igual volume de isopropanol gelado.
Posteriormente, o material foi incubado por dez minutos à temperatura ambiente, centrifugado de novo a 12 mil rpm, à temperatura de 4º Celsius, por dez minutos. O precipitado formado foi lavado com um mililitro de etanol 75%, centrifugado a 12 mil rpm, por um minuto. Depois, foi mantido à temperatura ambiente até a sua secagem e novamente mantido em 30 microlitros de água Milli-Q Rnase free. O RNA Total extraído foi armazenado em um freezer fundo, à temperatura de -80º Celsius.
A eficiência do protocolo foi verificada por meio da corrida do RNA extraído em gel de acarose a 0,8% (p/v), no qual observou-se a presença de bandas e concluiu-se que o protocolo é adequado à extração de RNA de folhas do algodoeiro.
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