A Universidade de Brasília e a Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia testaram quatro métodos para a obtenção de maior clareza na visualização por microscopia ótica de estruturas do isolado CEN 162 (Trichoderma asperellum).
O primeiro método consistiu em forrar placas de Petri com papel toalha umedecido e, sobre ele, colocar duas lâminas sobre suportes confeccionados com arame. Foram pipetados 100μL do meio de cultura BDA (Batata - Dextrose - Agar) na superfície das lâminas de vidro em cada uma de suas extremidades. Sobre a base do meio BDA solidificado, depositaram-se, opostamente, duas gotículas da suspensão fúngica à concentração de 109 esporo/mL. As gotas foram recobertas por lamínulas, permitindo dessa forma o crescimento do fungo. As placas de Petri assim preparadas foram vedadas com filme de PVC e incubadas em câmara de crescimento (B.O.D.) a 25º C.
A segunda metodologia diferiu da primeira apenas no procedimento de inoculação. Nesse caso, foi feita uma fenda no meio de cultura já solidificado, utilizando-se uma haste metálica quente, e, nesse corte, foi depositada a gotícula da suspensão de esporos do fungo.
Já o terceiro e o quarto método se diferiram dos anteriores pela aplicação de uma película de BDA em uma das faces das lamínulas, de forma homogênea, utilizando uma pipeta automática, quando o meio de cultura em estado líquido encontrava-se ainda em alta temperatura (acima de 40oC), para permitir melhor espalhamento. Contudo, o terceiro e o quarto métodos se diferenciaram entre si da mesma forma que os dois primeiros métodos.
Os quatros métodos foram testados em quatro diferentes tempos de cultivo: 48 hs; 72 hs; 96 hs e 120 hs. Também foram utilizados dois tratamentos luminosos, um com fotoperíodo de 12:12 (luz; escuro); outro sem fotoperíodo, ou seja , totalmente na escuridão. Esses tratamentos luminosos foram realizados em todos os quatro métodos nos diferentes tempos de cultivo.
No preparo das lâminas para visualização microscópica, o procedimento foi igual para todos os métodos. Uma gota do corante azul-de-algodão foi depositada sobre uma lâmina de vidro limpa. Em seguida, retirou-se uma das lamínulas de um dos meios de cultura com o fungo já crescido, colocando-a sobre a gota, de forma que as estruturas fúngicas aderidas à lamínula ficassem em contado com o corante. Para selagem das lamínulas, utilizou-se um esmalte, possibilitando a posterior visualização microscópica e foto-documentação.
Os dois últimos métodos foram os que produziram os melhores resultados, devido à utilização de uma película de BDA nas lamínulas, possibilitando adesão do fungo e favorecendo melhor visualização microscópica. As repetições feitas no escuro, ao proporcionarem crescimento menos adensado e amadurecimento mais lento das estruturas fúgicas, permitiram melhor visualização. Além disso, os melhores períodos de incubação foram os de 48 e 72 horas, embora eles possam variar, de acordo com a espécie e até mesmo entre isolados da mesma espécie.