O botão floral do algodoeiro contém grande quantidade de compostos fenólicos que são oxidados e, também, a presença de polissacarídeos que formam uma substância viscosa e interferem na qualidade do RNA. Portanto, o estabelecimento de uma metodologia eficiente para a extração de RNA do botão íntegro e de boa qualidade é fundamental para análise de expressão gênica como RT-PCR e a construção de bibliotecas de cDNA – DNA complementar. Estudo da Embrapa Algodão procurou estabelecer um protocolo que suporte as necessidades para a construção de uma biblioteca subtrativa de cDNA.
O Invisorb Spin Plant RNA mini kit foi usado com eficiência para a extração de RNA do botão floral. Mesmo com dificuldades, foi possível extrair RNA íntegro e de boa qualidade. Esse protocolo resultou na melhor recuperação de RNA, ao contrário dos demais, que recuperaram material degradado ou parcialmente degradado. A integridade do RNA total foi analisada por eletroforese em gel de agarose – 1,2% w/v.
Durante o trabalho, diversas estratégias foram adotadas, usando diferentes protocolos, tais como, Concert Trizol, tampão ácido bórico associado à precipitação com acetato de sódio e tertbutanol, tampão CTAB associado à precipitação com cloreto de lítio, tampão NTES associado à precipitação com acetato de sódio e tampão citrato de sódio associado à precipitação com cloreto de lítio.
Para evitar a contaminação por fenóis e a consequente oxidação do RNA, em alguns protocolos foram usadas substâncias como PVP, que facilita a lise celular e atua como agente redutor e desnaturando proteínas. Objetivando a desproteinização, utilizou-se também clorofane – fenol:clorofórmio:álcool isoamílico, 25:24:1. Apesar da eficiência desses protocolos na extração do RNA e de outros tecidos vegetais, como folhas, caule e raiz, na extração do botão floral do algodoeiro eles não produziram o efeito desejado.